荧光定量PCR操作步骤
荧光定量PCR是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技能，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产品进行标记盯梢，实时在线监控反应过程，结合相应的软件能够对产品进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
荧光定量PCR原理
PCR扩增时在参加一对引物的一起参加一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两头分别标记一个陈述荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，陈述基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA恣意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使陈述荧光基团和淬灭荧光基团别离，然后荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，完成了荧光信号的累积与PCR产品形成彻底同步。或者运用荧光染料SYBR。SYBR能够结合到双链DNA上面，当系统中的模板被扩增时，SYBR能够有用结合到新组成的双链上面，跟着PCR的进行，结合的SYBR燃料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，然后到达定量的意图。
荧光定量PCR试验过程：
样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其彻底溶解。
②两相别离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中参加0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振动管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为基层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时参加的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉积 将水相上层转移到一洁净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉积其间的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉积将在管底部和侧壁上形成胶状沉积块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中参加至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O制造），清洗RNA沉积。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 当心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉积在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉积 溶解RNA时，先参加无RNA酶的水40μl用枪重复吹打几次，使其彻底溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
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